蛋白樣品制備中各類雜質和雜蛋白的去除

蛋白樣品制備中，在細胞破碎之後，既可以利用特定蛋白質的特性來分離某一類蛋白質，比如親和純化，比如前面介紹的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一個考慮方向是去除雜質----去掉樣品中某些非目標高丰度蛋白或者雜質的干擾，同樣可以達到簡化樣本的目的。當然要小心「倒洗腳水的時候別把嬰兒也倒掉了」，一定要選擇可靠的產品。

比如，潛在疾病標誌物的樣本來源就是血清或其他體液，此類樣本可以提供人蛋白質組中絕大部分組份。然而用蛋白質組分析方法鑒定疾病標誌物zui大的挑戰來自於血清中大量的高丰度蛋白對檢測的干擾，血清中有大約55%的蛋白為白蛋白，而IgG大約佔血清中蛋白總量的10-25%，這些高丰度蛋白的存在會增加低丰度蛋白檢測的難度，去除佔血清總蛋白近75%的白蛋白和IgG將有助於更好地鑒定其他的蛋白。G-Biosciences的AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒堪稱白蛋白去除神器。血漿和腦脊髓液等樣本中，包含大量的白蛋白，從而封閉掉在二維凝膠電泳中發現和鑒定其他低丰度蛋白的可能。AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒被設計用來在這種樣本中大量去除白蛋白。

這種白蛋白去除方法是基於白蛋白和Cibachron藍色染料的結合。AlbuminOUT™被優化從樣本中去除人的白蛋白。AlbuminOUT™使用快速離心柱方法，每個柱子含有0.2ml的染料結合樹脂，從而可以結合大於2mg的人白蛋白。AlbuminOUT™可以從5-50微升人血漿中去除大於98%的白蛋白。

離心柱形式可以在10分鐘內去除白蛋白。高結合力的藍色染料結合樹脂可以從人，豬，羊，狗，兔，大鼠和牛樣本中達到瞬間的結合和去除白蛋白。AlbuminOUT™或許也可以從其他物種中去除白蛋白。適用於處理25或50個樣本。

Figure 1:  2D  analysis  of  whole  human  serum  before  (left)  and  after

(right) treatment with AlbminOUT^™.

產品特點：

• 從樣本中不到10分鐘的時間內去除白蛋白
• 基於白蛋白和Cibachron藍色染料的結合
• 每個柱子的結合力大於2mg的人白蛋白
• 從5-50微升人血漿中去除大於98%的白蛋白

去垢劑如SDS、Tween、Tritonde等是蛋白樣品處理過程中常用的組分。去污劑在蛋白提取和樣本制備過程中是很重要的物質，特別是研究疏水蛋白時。蛋白樣本中高濃度去污劑的存在能夠影響ELISA,IEF和蛋白的蛋白酶消化，以及用質譜進行分析時抑制肽的離子化。

所謂請神容易送神難。要除掉這些去垢劑？G-Biosciences推出的DetergentOUT™ GB-S10去污劑去除柱子和樹脂專門設計用來除於蛋白或其他生物樣本中所含有的去污劑，樹脂能夠從蛋白水溶液和肽樣本中去除自由的，未結合的陰離子的，非離子或兩性離子的去污劑(e.g. SDS, Triton® X-100 或CHAPS)，同時對於下游進行的質譜或其他技術的分析應用帶來zui小的樣本丟失。

DetergentOUT™ GB-S10柱子在第三方的研究使用中表明*兼容DI-QTOF和 LC-MS/MS（請見參考文獻）。DetergentOUT™ GB-S10柱子的使用顯著增加到了檢測到的肽光譜的數量。除此之外，DetergentOUT™ GB-S10柱子對於去污劑有高度的結合容量，比如每毫升固定的樹脂可以結合6mg SDS和14mg Triton® X-100。

Table 1:  A comparison of the detergent removal rates and percentage protein recovery with DetergentOUT^™ GBS10.

Tag蛋白的純化

帶有融合標籤的表達產物----融合蛋白的純化通常也是緊接細胞破碎工作進行的。設計融合標籤的主要目的之一就是為了方便後繼的親和純化。目前zui為流行的融合標籤自然是His-Tag，和GST，來自G-Biosciences等公司都有質量非常穩定可靠的產品，種類還特別豐富，分別對應不同的上樣量和工作壓力和流速的需要。筆者在這裡介紹一下江湖中盛傳的Tag蛋白純化的「刀劍笑」，目的就是為在產品選擇上幫你省點事......

「橫刀」-蛋白親和純化GST樹脂

G-Biosciences的谷胱甘肽樹脂，用於分離GST重組蛋白

用來親和純化帶有GST標籤的蛋白。樹脂由還原性的谷胱甘肽通過10個碳原子的間隔臂共價偶聯到4%交聯的瓊脂糖上組成。每毫升樹脂可以結合大約8mg GST標籤蛋白。樹脂浸在20%的乙醇中。谷胱甘肽樹脂有單獨的樹脂也有試劑盒形式提供。除了用於洗脫的還原性谷胱甘肽之外，結合/沖洗和洗脫緩衝液也有提供。

產品特點：

• 用於純化GST蛋白
• 高載量，8mg/ml
• 配基密度，7-15μmoles 谷胱甘肽/ml
• 樹脂尺寸，50-160μm
• 樹脂結構，4%交聯的瓊脂糖
• 10個碳原子的間隔臂

「名劍」-蛋白親和純化鎳螯合樹脂

用於分離6XHis標籤重組蛋白，高度結合效率和低的非特異性結合。

固定的金屬親和層析樹脂（IMAC）使用鎳離子來純化6XHis標籤蛋白。樹脂可以結合6X組氨酸殘基（6XHis），一種在蛋白純化中非常常用的標籤。樹脂由氨基二乙酸偶聯到6%交聯的瓊脂糖上組成。氨基二乙酸可以共價結合到鎳離子上，每毫升樹脂可以結合20-40μmoles鎳離子。

這種鎳螯合樹脂有單獨的樹脂也有離心柱形式供選擇。

特定的結合和洗脫緩衝液液可以提供，

100ml His結合/沖洗緩衝液

(10mM Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

100ml His洗脫緩衝液

(0.25M Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

產品特點：

• 用於純化6XHis標籤蛋白
• 高載量，大於50mg/ml
• 配基密度，每毫升樹脂結合20-40μmoles鎳離子
• 樹脂結構，6%交聯的瓊脂糖

「笑三少」-鈣調蛋白樹脂

鈣調蛋白樹脂用於親和純化鈣調蛋白結合蛋白（CBP），包括帶有CBP標籤的重組蛋白和真核生物中鈣調蛋白調控的蛋白。樹脂是4%的瓊脂糖偶聯到鈣調蛋白上，配基的密度是1ml樹脂大約是1mg鈣調蛋白。

鈣調蛋白樹脂有單獨的樹脂產品形式以及試劑盒形式，試劑盒包括：

5ml樹脂，

100ml鈣調蛋白結合/漂洗緩衝液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM CaCl2)

100ml鈣調蛋白洗脫緩衝液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM EGTA)

5個1ml離心空柱

5個空的小於5ml的重力流柱

緩衝液同時也可以單獨提供。

產品特點：

• 用於純化鈣調蛋白結合蛋白
• 結合CBP標籤的重組蛋白
• 高載量，~1-3mg/ml
• 樹脂尺寸，50-160μm
• 樹脂結構，4%高度交聯的瓊脂糖
• 配基密度，0.9-1.2mg 鈣調蛋白/ml 樹脂